一、什么是相差顯微鏡

相差顯微鏡是常見的一種顯微鏡，在很多實驗室中都可以見到，利用光線穿過透明樣品時產(chǎn)生的相位差轉(zhuǎn)換為圖像中的振幅或?qū)Ρ榷炔畹脑?，主要是用來觀察細(xì)菌，細(xì)胞等細(xì)胞結(jié)構(gòu)的透明樣品。因為它可以在自然狀態(tài)下檢查活細(xì)胞，而無需事先對細(xì)胞殺死、固定和染色的優(yōu)點，相差顯微鏡可以高清晰度和高對比度地觀察和記錄動態(tài)的生物過程，可以用來進行細(xì)胞周期等方向的研究。

相差顯微鏡的出現(xiàn)得益于相襯顯微技術(shù)的發(fā)明，相襯顯微技術(shù)是顯微技術(shù)的中的一個重大進步，它的發(fā)明人澤尼克也因此獲得了1953年的諾貝爾物理學(xué)獎。

二、相差顯微鏡的原理

相差顯微鏡的核心是一個位于聚光鏡孔徑光闌位置的相差環(huán)板和位于物鏡后方的相位板。首先光線從照明用的燈絲內(nèi)的一點射出，由場透鏡精確的聚焦在聚光鏡處的相差環(huán)板的開放處。由于這個位置處在聚光鏡的前焦平面，光線在通過聚光鏡后將變成平行光。假設(shè)這兩束光線在標(biāo)本處不發(fā)生衍射，它們將平行的射入物鏡，所有的平行光都會聚焦在物鏡后方的相位板上。但實際上，部分光線通過標(biāo)本以后部分光線將會發(fā)生衍射，為了完成調(diào)整相位的需求，需要調(diào)整物鏡后方的相位板即可。相位板的另一個作用是將未被標(biāo)本影響的光線減弱，用對中望遠(yuǎn)鏡觀察物鏡后方的相位板，可見減光材料形成的暗環(huán)。

物鏡后方的相位板由共軛面和補償面組成，共軛面為環(huán)狀，是直射光通過部分，通常涂有吸收光線的物質(zhì)，補償面位于共軛面的內(nèi)外兩側(cè)部分，是通過衍射光的部分。

光線通過相差環(huán)板射入，通過聚光鏡射出后形成平行的波陣面。當(dāng)這些平面波碰到樣本的時候，一些光在穿過標(biāo)本時發(fā)生衍射，改變了它們和直射光之間的相位關(guān)系，新產(chǎn)生的球面波在從標(biāo)本射出后相位將被延遲λ/4。注意到現(xiàn)在有兩種類型的波，直射光和衍射光，它們之間存在λ/4的相差。在正相襯中，共軛面只鍍有吸收膜，補償面則鍍有相位膜，這樣直射光A僅被吸收，振幅減少，相位未被推遲；而衍射光B的相位則被延遲λ/4，使其與直射光的相位相差λ/2（λ/4+λ/4），在中間相平面上的合成波C的振幅等于兩波振幅的差（引起相消干涉），這時樣本要比背景暗（因為背景只有直射光，被吸收，振幅減少），這就是正相襯的效果。

相反在負(fù)相襯中，由于相位板的共軛面不僅鍍有吸收膜，而且還鍍有相位膜，除了吸收直射光使其振幅減小外，而且也把直射光的相位延遲λ/4，這樣使直射光A與衍射光B維持同一相位，則合成波C等于直射波與衍射波振幅的和（引起相長干涉），因背景只有直射光的照明，而樣本則比背景明亮。

這樣就通過相差顯微鏡改變直射光或衍射光的相位，把人眼無法鑒別的相位差變成了眼睛能測量到達(dá)視網(wǎng)膜的光線能量強度振幅差（明暗差），在觀察細(xì)胞的時候也就不會對細(xì)胞標(biāo)本產(chǎn)生傷害。

三、相差顯微鏡的優(yōu)勢

相差顯微鏡可以觀察未經(jīng)染色的活細(xì)胞等樣品，相對于其它對比增強技術(shù)，如DIC，相差顯微鏡不使用偏振光照明，因而可以觀察雙折射介質(zhì)，如透過塑料培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿進行活細(xì)胞觀察，可以清楚觀察到樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)（如細(xì)胞核），這在細(xì)胞學(xué)研究上特別有用。如和落射熒光技術(shù)連用，相差物鏡可以透過約70%的激發(fā)光，優(yōu)于DIC，所以相差往往作為輔助成像功能應(yīng)用在熒光顯微鏡上。此外，相差套件的采購價位相對較低，使用調(diào)校也較為簡單。

但是相襯顯微技術(shù)存在一些固有的不足。由于必須使用環(huán)形光闌，啟用相襯照明時聚光鏡的數(shù)值孔徑有所限制，所以相襯成像的軸向分辨率較低。另外，標(biāo)本和背景折射率差異較大的分界處會出現(xiàn)明顯的光暈，導(dǎo)致如細(xì)胞膜、細(xì)胞器外緣等位置的細(xì)節(jié)被遮蔽。

四、相差顯微鏡的應(yīng)用

相差顯微鏡主要用于對透明標(biāo)本的高對比度成像，如活細(xì)胞（通常在培養(yǎng)基中）、薄組織切片、光刻圖案、纖維、乳膠分散體、玻璃碎片和亞細(xì)胞顆粒（包括細(xì)胞核和其他細(xì)胞器）。

另外相差顯微鏡廣泛應(yīng)用于臨床中，新鮮液體標(biāo)本中細(xì)胞和微生物的檢查,尤其適用于活細(xì)胞檢查。一般是取新鮮液體標(biāo)本,加上蓋玻片(如用油鏡時,還需在蓋玻片上滴加鏡油)立即進行檢驗。如：血液學(xué)檢驗中用于血小板計數(shù)、血液中寄生蟲檢查和某些活細(xì)胞觀察等；微生物學(xué)檢驗中用于不染色或染不上色的細(xì)菌、螺旋體、真菌孢子等的快速辨認(rèn),特別是對具有鞭毛、莢膜等特殊形態(tài)微生物的鑒別，還有尿分析中用于辨認(rèn)新鮮尿中各種細(xì)胞和管型,特別是透明管型、白細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞以及紅細(xì)胞形態(tài)的分類等。

五、相差顯微鏡的使用方法

1.打開顯微鏡明場電源開關(guān)（“︱”為開，“O”為關(guān)）
2.將樣品置于載物臺上
3.將顯微鏡光路調(diào)至目鏡觀察位置
4.從低倍鏡開始觀察，調(diào)節(jié)到與鏡頭相匹配的相差環(huán)，熒光濾塊調(diào)到空檔的位置
5.調(diào)節(jié)透射光光強，調(diào)節(jié)焦距，找到預(yù)觀察視野
6.依次換到高倍鏡，（注意調(diào)節(jié)相差環(huán)）觀察樣品
7.拍照時將光路選擇調(diào)至相機拍攝位置

注意：
1. 光源亮度和孔徑光闌應(yīng)適當(dāng)調(diào)大，因為相差環(huán)板和相位板遮掉大部分光源；
2. 樣品不能太厚，以5-10ｕｍ左右為宜，否則將影響成像質(zhì)量；
3. 選取高品質(zhì)載玻片和蓋玻片，厚度等應(yīng)符合標(biāo)準(zhǔn)；
4. 安裝時應(yīng)把每個相差環(huán)調(diào)節(jié)到最佳狀態(tài)。

廣州浩康生物科技有限公司